Articles

Sammenligning Av Guide-it Mutation Detection Kit med EN cel nuclease-basert analyse

Posted by admin

EN PCR-basert metode for å bekrefte tilstedeværelsen av mutasjoner

Mutasjonsdeteksjon er ofte basert PÅ PCR-forsterkning av regionen av interesse og påvisning av uoverensstemmelser i heteroduplexed DNA. Med Guide-it Mutation Detection Kit forsterkes målsekvensen direkte fra celler, uten genomisk DNA-ekstraksjon/rensing (Figur 1, trinn 1). DERETTER blir PCR-produktene smeltet og rehybridisert, og danner feilaktige mål som kan spaltes av Guiden – Det Resolvase (Figur 1, trinn 2 og 3).

Figur 1. Oversikt Over Guide-it Mutation Detection Kit-metoden for å bekrefte tilstedeværelsen av mutasjoner i genomisk DNA.

Figur 1. Oversikt Over Guide-it Mutation Detection Kit-metoden for å bekrefte tilstedeværelsen av mutasjoner i genomisk DNA.

Sammenligning Av Guide-it Mutation Detection Kit med EN cel nuklease-basert analyse

nøkkelkomponenten I Guide-it Mutation Detection Kit er Guide-it Resolvase, en mismatch-spesifikk nuklease som gjenkjenner heterodupleksert DNA. Dette enzymet er mer effektivt og mer robust enn andre lignende nukleaser, for eksempel Cel1.To sammenlign Guide-it-systemet og en analyse basert PÅ cel-nuklease for å oppdage CRISPR / Cas9-introduserte mutasjoner i pattedyrceller, 293T-celler ble transfisert med plasmider som koder For Cas9 og en sgRNA spesifikk FOR aavs1-lokusen. Transfiserte celler høstet 48 timer etter transfeksjon ble blandet med ikke-transfiserte celler i varierende forhold (Figur 2, øverst). ET DNA-fragment som inneholdt aavs1 locus ble generert AV PCR ved Bruk Av Terra Direct Polymerase, og produktene ble renset og spaltet med Enten Guide – It Resolvase (Guide-it Mutation Detection Kit) eller Cel1-enzymet (Selskap T). Mutasjoner var lett merkbare ved bruk Av Guide-it-settet (Figur 2, bunn). I motsetning viste CEL-analysen betydelig smøring, noe som gjorde det vanskelig å bestemme spaltningseffektivitet og redusere evnen til å oppdage lavere mutasjonsnivåer (Figur 2, bunn).

Figur 2. Sammenligning Av Guide-it Mutation Detection kit og EN cel nuclease assay for å oppdage CRISPR / Cas9-introduserte mutasjoner i pattedyrceller. Mutasjoner var lett merkbar ved bruk Av Guide-it kit (estimering av cleavage, 1: 59%, 2: 46%, 3: 28%, 4: 15%, 5: 10%, 6: 0%). I motsetning viste CEL-nukleaseanalysen betydelig smøring, noe som gjorde det vanskelig å bestemme spaltningseffektivitet og redusere evnen til å oppdage lave mutasjonsnivåer.

Figur 2. Sammenligning Av Guide-it Mutation Detection kit og EN cel nuclease assay for å oppdage CRISPR / Cas9-introduserte mutasjoner i pattedyrceller. Mutasjoner var lett merkbar ved bruk Av Guide-it kit (estimering av cleavage, 1: 59%, 2: 46%, 3: 28%, 4: 15%, 5: 10%, 6: 0%). I motsetning viste CEL-nukleaseanalysen betydelig smøring, noe som gjorde det vanskelig å bestemme spaltningseffektivitet og redusere evnen til å oppdage lave mutasjonsnivåer.

Figur 2. Sammenligning Av Guide-it Mutation Detection kit og EN cel nuclease assay for å oppdage CRISPR / Cas9-introduserte mutasjoner i pattedyrceller. Mutasjoner var lett merkbar ved bruk Av Guide-it kit (estimering av cleavage, 1: 59%, 2: 46%, 3: 28%, 4: 15%, 5: <10%, 6: 0%). I motsetning viste CEL-nukleaseanalysen betydelig smøring, noe som gjorde det vanskelig å bestemme spaltningseffektivitet og redusere evnen til å oppdage lave mutasjonsnivåer.

Related Post

Leave A Comment