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Guide-it変異検出キットとCELヌクレアーゼベースアッセイの比較

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変異の存在を確認するためのPCRベースの方法

変異検出は、多くの場合、関心領域のPCR増幅 Guide-it Mutation Detection Kitを使用すると、ゲノムDNAの抽出/精製なしに、標的配列を細胞から直接増幅することができます(図1、ステップ1)。 次に、PCR産物を溶融して再架橋させ、ガイドイットレゾルバーゼによって切断することができる不一致の標的を形成する(図1、ステップ2および3)。

図1. Guide-it変異検出キットの概要ゲノムDNAに変異が存在することを確認する方法。

図1. Guide-it変異検出キットの概要ゲノムDNAに変異が存在することを確認する方法。

Guide-it変異検出キットとCELヌクレアーゼベースアッセイの比較

Guide-it変異検出キットの重要なコンポーネントは、ヘテロ二重DNAを認識するミスマッチ特 この酵素は、以下のような他の同様のヌクレアーゼよりも効率的で堅牢であるCel1.To Guide−ITシステムとCELヌクレアーゼに基づくアッセイを比較して、哺乳動物細胞におけるCRISPR/Cas9導入突然変異を検出するために、2 9 3T細胞を、CAS9をコードするプラスミドおよびAAVS1遺伝子座に特異的なsgRNAでトランスフェクトした。 トランスフェクションの48時間後に回収されたトランスフェクション細胞を、様々な比率で非トランスフェクション細胞と混合した(図2、上)。 TERRA Direct Polymeraseを用いたPCRによりAAVS1遺伝子座を含むDNA断片を作製し、生成物をGuide−it Resolvase(Guide−it Mutation Detection Kit)またはCel1酵素(T社)で精製し切断した。 Guide-itキットを使用すると、変異は容易に識別できました(図2、下)。 対照的に、CELアッセイはかなりの塗抹標本を示し、切断効率を決定することを困難にし、より低いレベルの突然変異を検出する能力を低下させた(図2、下)。

図2. 哺乳動物細胞におけるCRISPR/Cas9導入突然変異を検出するためのGUIDE−it突然変異検出キットおよびCELヌクレアーゼアッセイの比較。 変異は、Guide-itキット(切断の推定)を使用すると容易に識別できました, 1: 59%, 2: 46%, 3: 28%, 4: 15%, 5: 10%, 6: 0%). 対照的に、CELヌクレアーゼアッセイは、それが困難な切断効率を決定すること、変異の低レベルを検出する能力を低下させる、かなりの塗抹を示した。

図2. 哺乳動物細胞におけるCRISPR/Cas9導入突然変異を検出するためのGUIDE−it突然変異検出キットおよびCELヌクレアーゼアッセイの比較。 変異は、Guide-itキット(切断の推定)を使用すると容易に識別できました, 1: 59%, 2: 46%, 3: 28%, 4: 15%, 5: 10%, 6: 0%). 対照的に、CELヌクレアーゼアッセイは、それが困難な切断効率を決定すること、変異の低レベルを検出する能力を低下させる、かなりの塗抹を示した。

図2. 哺乳動物細胞におけるCRISPR/Cas9導入突然変異を検出するためのGUIDE−it突然変異検出キットおよびCELヌクレアーゼアッセイの比較。 変異は、Guide-itキット(切断の推定)を使用すると容易に識別できました, 1: 59%, 2: 46%, 3: 28%, 4: 15%, 5: <10%, 6: 0%). 対照的に、CELヌクレアーゼアッセイは、それが困難な切断効率を決定すること、変異の低レベルを検出する能力を低下させる、かなりの塗抹を示した。

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