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Essential technical tips for STAP cell conversion culture from somatic cells

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GLI AUTORI STANNO RITIRANDO QUESTO PROTOCOLLO PROTOCOLLO DI SCAMBIO PERCHÉ I DOCUMENTI SU CUI SI BASA SONO STATI RETRATTI.

L’acquisizione di pluripotenza innescata dallo stimolo (STAP) è un fenomeno di riprogrammazione cellulare che è stato recentemente riportato in due documenti (Obokata, Nature, 2014a,b). In questo processo di riprogrammazione, su forti stimoli esterni, le cellule somatiche neonatali vengono convertite in cellule che esprimono geni correlati alla pluripotenza, come Oct3/4, e acquisiscono la capacità di differenziarsi in derivati di tutti e tre gli strati germinali in vitro e in vivo. Queste cellule, chiamate cellule STAP, possono contribuire ai feti chimerici dopo l’iniezione di blastocisti. Inoltre, nel test di iniezione di blastocisti, le cellule STAP iniettate si trovano anche nei tessuti extra-embrionali, come la placenta.

Le cellule STAP derivate da cellule somatiche neonatali sono quindi completamente riprogrammate allo stato di pluripotenza. Nelle condizioni per la creazione di cellule STAP, la loro capacità proliferativa è piuttosto limitata, distinta da quella delle cellule staminali embrionali (ESC). Le cellule STAP possono essere ulteriormente convertite in due tipi di linee cellulari proliferative: cellule staminali STAP e cellule staminali indotte da FGF4 (cellule staminali FI). Le cellule staminali STAP, che vengono convertite da cellule STAP in mezzo contenente ACTH (vedi Procedura), perdono la capacità di contribuire ai tessuti extra-embrionali. Le cellule staminali di FI, che sono generate dalle cellule STAP nel mezzo contenente FGF4, al contrario mantengono la capacità di contribuire sia ai lignaggi embrionali che extra-embrionali nel saggio di iniezione di blastocisti, sebbene il loro contributo embrionale sia relativamente basso.

Il fenomeno STAP indotto da stimoli esterni, quindi potenzialmente getta nuova luce sulla nostra comprensione della pluripotenza e della differenziazione nelle cellule di mammifero. Questo fenomeno imprevisto può essere innescato nelle cellule ematopoietiche neonatali, ad esempio, dall’esposizione transitoria a una soluzione a basso pH. Nonostante la sua apparente semplicità, questa procedura richiede particolare attenzione nella gestione delle cellule e nelle condizioni di coltura, nonché nella scelta della popolazione cellulare iniziale. L’erogazione del livello ottimale di stress subletale alle cellule è essenziale per il processo di induzione delle cellule STAP. Dalla nostra esperienza, la conversione STAP è riproducibile con condizioni di coltura in cui la maggior parte delle cellule sopravvive per un giorno dopo un trattamento a basso pH e in cui fino all ‘ 80% del numero di cellule iniziale muore successivamente intorno ai giorni 2-3. Il controllo del pH della soluzione non è l’unico fattore chiave; anche l’insorgenza ritardata dello stress subletale è di fondamentale importanza. Questo contesto biologico può anche essere influenzato da molti altri fattori. Ad esempio, la preparazione delle cellule somatiche e la manipolazione delle cellule prima e dopo l’esposizione allo stress devono essere eseguite con cura, poiché ulteriori danni alle cellule possono alterare il livello di stress, causando un’eccessiva morte cellulare o un’attivazione insufficiente. Anche i tipi di cellule utilizzate per la conversione STAP sono critici e l’uso di cellule provenienti da altre fonti (ad esempio, l’uso di fibroblasti in coltura dopo il passaggio) può anche causare un fallimento nel raggiungere la conversione STAP. Abbiamo osservato riproducibilmente la conversione delle cellule STAP quando le procedure appropriate sono seguite nella sequenza corretta.

Per facilitare l’ampio test e l’uso di questa tecnica, stiamo ora preparando un articolo completo del protocollo con le istruzioni passo-passo. Tuttavia, poiché la preparazione, la presentazione e la pubblicazione di un manoscritto completo richiede una notevole quantità di tempo, vorremmo condividere una serie di suggerimenti tecnici per la coltura di conversione cellulare STAP (e relativi esperimenti) in questo scambio di protocolli. Speriamo che questi suggerimenti tecnici possano rispondere a molte domande frequenti sui dettagli sperimentali.

Parole chiave
Celle STAP, riprogrammazione, pluripotenza

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