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Comparaison du Kit de Détection de mutation Guide-it avec un test basé sur la nucléase CEL

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Une méthode basée sur la PCR pour confirmer la présence de mutations

La détection de mutations est souvent basée sur l’amplification par PCR de la région d’intérêt et la détection de non-concordances dans l’ADN hétéroduplexé. Avec le Kit de détection de mutation Guide-it, la séquence cible est amplifiée directement à partir des cellules, sans extraction/purification de l’ADN génomique (Figure 1, étape 1). Ensuite, les produits PCR sont fondus et rehybridés, formant des cibles dépareillées qui peuvent être clivées par la Résolvase Guide-it (Figure 1, étapes 2 et 3).

 Figure 1. Aperçu de la méthode du Kit de détection de mutations Guide-it pour confirmer la présence de mutations dans l'ADN génomique.

Figure 1. Aperçu de la méthode du Kit de détection de mutations Guide-it pour confirmer la présence de mutations dans l’ADN génomique.

Comparaison du Kit de Détection de Mutation Guide-it avec un test basé sur la nucléase CEL

L’élément clé du Kit de Détection de mutation Guide-it est la Résolvase Guide-it, une nucléase spécifique à l’inadéquation qui reconnaît l’ADN hétéroduplexé. Cette enzyme est plus efficace et plus robuste que d’autres nucléases similaires, telles que Cel1.To en comparant le système Guide-it et un test basé sur la nucléase CEL pour détecter les mutations introduites par CRISPR/Cas9 dans des cellules de mammifères, des cellules 293T ont été transfectées avec des plasmides codant pour Cas9 et un ARNSG spécifique du locus AAVS1. Les cellules transfectées récoltées 48 heures après la transfection ont été mélangées à des cellules non transfectées à des rapports variables (Figure 2, en haut). Un fragment d’ADN contenant le locus AAVS1 a été généré par PCR à l’aide de la Polymérase Terra Direct, et les produits ont été purifiés et clivés avec soit la Résolvase Guide-it (Kit de Détection de mutation Guide-it), soit l’enzyme Cel1 (Société T). Les mutations étaient facilement discernables lors de l’utilisation du kit Guide-it (Figure 2, en bas). En revanche, le test CEL a montré un maculage considérable, ce qui rend difficile la détermination de l’efficacité du clivage et réduit la capacité de détecter des niveaux de mutation plus faibles (figure 2, bas).

 Figure 2. Comparaison du kit de détection de mutations Guide-it et d'un test de nucléase CEL pour détecter les mutations introduites par CRISPR/Cas9 dans les cellules de mammifères. Les mutations étaient facilement discernables lors de l'utilisation du kit Guide-it (estimation du clivage, 1: 59%, 2: 46%, 3: 28%, 4: 15%, 5: 10%, 6: 0%). En revanche, le test de la nucléase CEL a montré un maculage considérable, ce qui rend difficile la détermination de l'efficacité du clivage et réduit la capacité de détecter de faibles niveaux de mutation.

 Figure 2. Comparaison du kit de détection de mutations Guide-it et d'un test de nucléase CEL pour détecter les mutations introduites par CRISPR/Cas9 dans les cellules de mammifères. Les mutations étaient facilement discernables lors de l'utilisation du kit Guide-it (estimation du clivage, 1: 59%, 2: 46%, 3: 28%, 4: 15%, 5: 10%, 6: 0%). En revanche, le test de la nucléase CEL a montré un maculage considérable, ce qui rend difficile la détermination de l'efficacité du clivage et réduit la capacité de détecter de faibles niveaux de mutation.

Figure 2. Comparaison du kit de détection de mutations Guide-it et d’un test de nucléase CEL pour détecter les mutations introduites par CRISPR/Cas9 dans les cellules de mammifères. Les mutations étaient facilement discernables lors de l’utilisation du kit Guide-it (estimation du clivage, 1: 59%, 2: 46%, 3: 28%, 4: 15%, 5: <10%, 6: 0%). En revanche, le test de la nucléase CEL a montré un maculage considérable, ce qui rend difficile la détermination de l’efficacité du clivage et réduit la capacité de détecter de faibles niveaux de mutation.

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