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Vergleich des Guide-it-Mutationsnachweiskits mit einem CEL-Nuklease-basierten Assay

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Eine PCR-basierte Methode zur Bestätigung des Vorhandenseins von Mutationen

Der Mutationsnachweis basiert häufig auf der PCR-Amplifikation der interessierenden Region und dem Nachweis von Fehlpaarungen in heteroduplexierter DNA. Mit dem Guide-it Mutation Detection Kit wird die Zielsequenz ohne genomische DNA-Extraktion/-aufreinigung direkt aus Zellen amplifiziert (Abbildung 1, Schritt 1). Dann werden die PCR-Produkte geschmolzen und rehybridisiert, wodurch nicht übereinstimmende Targets gebildet werden, die von der Guide-it-Resolvase gespalten werden können (Abbildung 1, Schritte 2 und 3).

 Abbildung 1. Überblick über die Guide-it Mutation Detection Kit-Methode zur Bestätigung des Vorhandenseins von Mutationen in genomischer DNA.

Abbildung 1. Überblick über die Guide-it Mutation Detection Kit-Methode zur Bestätigung des Vorhandenseins von Mutationen in genomischer DNA.

Vergleich des Guide-it-Mutationsnachweiskits mit einem CEL-Nuklease-basierten Assay

Die Schlüsselkomponente des Guide-it-Mutationsnachweiskits ist die Guide-it-Resolvase, eine Mismatch-spezifische Nuklease, die heteroduplexierte DNA erkennt. Dieses Enzym ist effizienter und robuster als andere ähnliche Nukleasen, wie zum Beispiel Cel1.To mit dem Guide-it-System und einem auf CEL-Nuklease basierenden Assay zum Nachweis von CRISPR/Cas9-eingeführten Mutationen in Säugerzellen wurden 293T-Zellen mit Plasmiden transfiziert, die für Cas9 und eine für den AAVS1-Locus spezifische sgRNA kodieren. Transfizierte Zellen, die 48 Stunden nach der Transfektion geerntet wurden, wurden mit nicht transfizierten Zellen in unterschiedlichen Verhältnissen gemischt (Abbildung 2, oben). Ein DNA-Fragment, das den AAVS1-Locus enthielt, wurde durch PCR unter Verwendung von Terra Direct Polymerase erzeugt, und die Produkte wurden entweder mit Guide-it Resolvase (Guide-it Mutation Detection Kit) oder dem Cel1-Enzym (Firma T) gereinigt und gespalten. Mutationen waren bei Verwendung des Guide-it-Kits leicht erkennbar (Abbildung 2, unten). Im Gegensatz dazu zeigte der CEL-Assay ein beträchtliches Verschmieren, was die Bestimmung der Spalteffizienz erschwert und die Fähigkeit verringert, niedrigere Mutationsniveaus nachzuweisen (Abbildung 2, unten).

 Abbildung 2. Vergleich des Guide-it-Mutationsnachweiskits und eines CEL-Nuklease-Assays zum Nachweis von CRISPR / Cas9-eingeführten Mutationen in Säugetierzellen. Mutationen waren bei Verwendung des Guide-it-Kits (Schätzung der Spaltung) leicht erkennbar, 1: 59%, 2: 46%, 3: 28%, 4: 15%, 5: 10%, 6: 0%). Im Gegensatz dazu zeigte der CEL-Nuklease-Assay ein beträchtliches Verschmieren, was die Bestimmung der Spalteffizienz erschwert und die Fähigkeit zum Nachweis geringer Mutationsniveaus verringert.

 Abbildung 2. Vergleich des Guide-it-Mutationsnachweiskits und eines CEL-Nuklease-Assays zum Nachweis von CRISPR / Cas9-eingeführten Mutationen in Säugetierzellen. Mutationen waren bei Verwendung des Guide-it-Kits (Schätzung der Spaltung) leicht erkennbar, 1: 59%, 2: 46%, 3: 28%, 4: 15%, 5: 10%, 6: 0%). Im Gegensatz dazu zeigte der CEL-Nuklease-Assay ein beträchtliches Verschmieren, was die Bestimmung der Spalteffizienz erschwert und die Fähigkeit zum Nachweis geringer Mutationsniveaus verringert.

Abbildung 2. Vergleich des Guide-it-Mutationsnachweiskits und eines CEL-Nuklease-Assays zum Nachweis von CRISPR / Cas9-eingeführten Mutationen in Säugetierzellen. Mutationen waren bei Verwendung des Guide-it-Kits (Schätzung der Spaltung) leicht erkennbar, 1: 59%, 2: 46%, 3: 28%, 4: 15%, 5: <10%, 6: 0%). Im Gegensatz dazu zeigte der CEL-Nuklease-Assay ein beträchtliches Verschmieren, was die Bestimmung der Spalteffizienz erschwert und die Fähigkeit zum Nachweis geringer Mutationsniveaus verringert.

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