Articles

Essential technical tips for STAP cell conversion culture from somatic cells

Posted by admin

DIE AUTOREN ZIEHEN DIESES PROTOKOLL-AUSTAUSCHPROTOKOLL ZURÜCK, WEIL DIE PAPIERE, AUF DENEN ES BASIERT, ZURÜCKGEZOGEN WURDEN.

Stimulus-triggered Acquisition of Pluripotency (STAP) ist ein zelluläres Umprogrammierungsphänomen, über das kürzlich in zwei Artikeln berichtet wurde (Obokata, Nature, 2014a,b). Bei diesem Umprogrammierungsprozess werden neonatale Körperzellen bei starken äußeren Reizen in Zellen umgewandelt, die pluripotenzbezogene Gene wie Oct3 / 4 exprimieren und in vitro und in vivo die Fähigkeit erwerben, sich in Derivate aller drei Keimschichten zu differenzieren. Diese Zellen, die als STAP-Zellen bezeichnet werden, können nach der Blastozysteninjektion zu chimären Föten beitragen. Darüber hinaus werden im Blastozysten-Injektionstest injizierte STAP-Zellen auch in extraembryonalen Geweben wie Plazenta gefunden.

STAP-Zellen, die aus neonatalen Körperzellen stammen, werden somit vollständig in den Zustand der Pluripotenz umprogrammiert. Unter den Bedingungen für die Etablierung von STAP-Zellen ist ihre Proliferationskapazität ziemlich begrenzt und unterscheidet sich von der von embryonalen Stammzellen (ESCs). STAP-Zellen können weiter in zwei Arten von proliferativen Zelllinien umgewandelt werden: STAP-Stammzellen und FGF4-induzierte Stammzellen (FI-Stammzellen). STAP-Stammzellen, die aus STAP-Zellen in ACTH-haltigem Medium umgewandelt werden (siehe Verfahren), verlieren die Fähigkeit, zu extraembryonalen Geweben beizutragen. FI-Stammzellen, die aus STAP-Zellen in FGF4-haltigem Medium erzeugt werden, behalten im Gegensatz dazu die Fähigkeit, sowohl zu embryonalen als auch zu extraembryonalen Linien im Blastozysteninjektionsassay beizutragen, obwohl ihr embryonaler Beitrag relativ gering ist.

Das durch äußere Reize induzierte STAP-Phänomen wirft somit potenziell ein neues Licht auf unser Verständnis von Pluripotenz und Differenzierung in Säugetierzellen. Dieses unvorhergesehene Phänomen kann in neonatalen hämatopoetischen Zellen ausgelöst werden, beispielsweise durch vorübergehende Exposition gegenüber Lösungen mit niedrigem pH-Wert. Trotz seiner scheinbaren Einfachheit erfordert dieses Verfahren besondere Sorgfalt bei der Zellhandhabung und den Kulturbedingungen sowie bei der Wahl der Startzellpopulation. Die Abgabe des optimalen Niveaus an subletalem Stress an Zellen ist für den Prozess der STAP-Zellinduktion unerlässlich. Aus unserer Erfahrung ist die STAP-Umwandlung reproduzierbar bei Kulturbedingungen zu sehen, bei denen die meisten Zellen nach einer Behandlung mit niedrigem pH-Wert einen Tag überleben und bei denen bis zu 80% der anfänglichen Zellzahl anschließend an den Tagen 2-3 absterben. Die Kontrolle des pH-Wertes der Lösung ist nicht der einzige Schlüsselfaktor; der verzögerte Beginn von subletalem Stress ist ebenfalls von entscheidender Bedeutung. Dieser biologische Kontext kann auch von vielen anderen Faktoren beeinflusst werden. Zum Beispiel müssen somatische Zellpräparation und Zellhandling vor und nach der Belastung mit Stress mit Vorsicht erfolgen, da zusätzliche Schäden an den Zellen das Stressniveau verändern können, was zu übermäßigem Zelltod oder unzureichender Auslösung führt. Die Arten von Zellen, die für die STAP-Konvertierung verwendet werden, sind ebenfalls kritisch, und die Verwendung von Zellen aus anderen Quellen (z. B. die Verwendung von kultivierten Fibroblasten nach der Passage) kann ebenfalls dazu führen, dass die STAP-Konvertierung nicht erreicht wird. Wir haben die STAP-Zellumwandlung reproduzierbar beobachtet, wenn die richtigen Verfahren in der richtigen Reihenfolge befolgt werden.

Um das breite Testen und Anwenden dieser Technik zu erleichtern, bereiten wir jetzt einen vollständigen Protokollartikel mit schrittweisen Anweisungen vor. Da die Vorbereitung, Einreichung und Veröffentlichung eines vollständigen Manuskripts jedoch viel Zeit in Anspruch nimmt, möchten wir in diesem Protokollaustausch einige technische Tipps für die STAP-Zellkonversionskultur (und verwandte Experimente) geben. Wir hoffen, dass diese technischen Tipps viele häufig gestellte Fragen zu den experimentellen Details beantworten können.

Schlüsselwörter
STAP-Zellen, Neuprogrammierung, Pluripotenz

Related Post

Leave A Comment