Articles

základní technické tipy pro konverzní kulturu STAP buněk ze somatických buněk

Posted by admin

autoři stahují tento protokol výměny protokolu, protože dokumenty, na nichž je založen, byly staženy.

získání Pluripotence vyvolané stimulem (STAP) je fenomén buněčného přeprogramování, který byl nedávno popsán ve dvou dokumentech (Obokata, Nature, 2014a, b). V tomto procesu přeprogramování jsou novorozenecké somatické buňky na silných vnějších podnětech přeměněny na buňky, které exprimují geny související s pluripotencí, jako je Oct3/4, a získávají schopnost diferencovat se na deriváty všech tří zárodečných vrstev in vitro a in vivo. Tyto buňky, nazývané STAP buňky, mohou přispívat k chimérickým plodům po injekci blastocysty. Navíc v injekčním testu blastocysty se injikované STAP buňky nacházejí také v extraembryonálních tkáních, jako je placenta.

stap buňky odvozené z neonatálních somatických buněk jsou tedy plně přeprogramovány na stav pluripotence. V podmínkách pro vytvoření STAP buněk je jejich proliferativní kapacita poměrně omezená, odlišná od embryonálních kmenových buněk (Esc). STAP buňky mohou být dále přeměněny na dva typy proliferativních buněčných linií: kmenové buňky STAP a kmenové buňky indukované FGF4 (kmenové buňky FI). Kmenové buňky STAP, které jsou přeměněny z buněk STAP v médiu obsahujícím ACTH (viz postup), ztrácejí schopnost přispívat k extraembryonálním tkáním. FI kmenové buňky, které jsou generovány z STAP buněk v médiu obsahujícím FGF4, si naopak zachovávají schopnost přispívat k embryonálním i extraembryonálním liniím v injekčním testu blastocysty, i když jejich embryonální příspěvek je relativně nízký.

fenomén STAP indukovaný vnějšími podněty tak potenciálně vrhá nové světlo na naše chápání pluripotence a diferenciace v savčích buňkách. Tento nepředvídaný jev může být vyvolán v novorozeneckých hematopoetických buňkách, například přechodnou expozicí roztoku s nízkým pH. Navzdory zdánlivé jednoduchosti vyžaduje tento postup zvláštní péči při manipulaci s buňkami a kultivačních podmínkách, jakož i při výběru počáteční buněčné populace. Dodávka optimální úrovně subletálního stresu do buněk je nezbytná pro proces indukce STAP buněk. Z našich zkušeností je konverze STAP reprodukovatelná s kultivačními podmínkami, ve kterých většina buněk přežívá jeden den po léčbě nízkým pH a ve kterých až 80% počátečního počtu buněk následně zemře přibližně ve dnech 2-3. Kontrola pH roztoku není jediným klíčovým faktorem; kriticky důležitý je také zpožděný nástup subletálního stresu. Tento biologický kontext může být také ovlivněn mnoha dalšími faktory. Například příprava somatických buněk a manipulace s buňkami před a po vystavení stresu musí být prováděna opatrně,protože další poškození buněk může změnit úroveň stresu, což způsobuje nadměrnou buněčnou smrt nebo nedostatečné spouštění. Typy buněk používaných pro konverzi STAP jsou také kritické a použití buněk z jiných zdrojů (např. použití kultivovaných fibroblastů po pasážování) může také vést k selhání dosažení konverze STAP. Reprodukovatelně jsme pozorovali konverzi stap buněk, když jsou dodržovány správné postupy ve správném pořadí.

abychom usnadnili široké testování a použití této techniky, připravujeme nyní celý článek protokolu s podrobnými pokyny. Vzhledem k tomu, že příprava, odeslání a zveřejnění úplného rukopisu trvá značné množství času, rádi bychom se v této výměně protokolů podělili o řadu technických tipů pro kulturu konverze buněk STAP (a související experimenty). Doufáme, že tyto technické tipy mohou odpovědět na mnoho často kladených otázek o experimentálních detailech.

klíčová slova
STAP buňky, přeprogramování, pluripotence

Related Post